Порівняння трьох методів ізоляції ДНК із іксодових кліщів
Анотація
Іксодові кліщі – це членистоногі ектопаразити тварин і людини, які переносять велике різноманіття патогенних мікроорганізмів. Кліщі можуть спричиняти патологічні стани, такі як паралічі, лихоманки, токсикози та алергії, а також велику кількість інфекційних та інвазійних захворювань. Метою нашого дослідження було порівняння трьох методів ізоляції ДНК, перевірка їх ефективності та практичності у отриманні матеріалу з кліщів і визначення їх впливу на результати ПЛР-досліджень. Протягом 2018 року кліщі були зібрані з рослинності методом «на прапор», а також від тварин в Хмельницькій та Чернівецькій областях. Для ізоляції ДНК використовували три різні методи: подрібнення кліщів ножицями та лізис в гідроксиді амонію, подрібнення ножицями з подальшою екстракцією ДНК з комерційним набором Genomic Mini AX Tissue Spin (A&A Biotechnology, Gdynia, Poland), гомогенізація кліщів за допомогою програмованого кріогенного гомогенізатора SPEX Sample Prep Freezer Mill 6875 з подальшою екстракцією ДНК з комерційним набором Genomic Mini AX Tissue Spin.
Всього за допомогою ПЛР було досліджено 72 кліщі (60 D. reticulatus і 12 I. ricinus) з рослинності на наявність збудників Babesia spp, Rickettsia spp., Borrelia spp. Отже, при першому способі виділення ДНК було виявлено 4,2 % кліщів позитивних на Babesia spp.. При дослідженні на Rikettsia spp. було виявлено три позитивних кліща (12,5%), на Borrelia spp – 8 кліщів (33,3%). При другому способі виділення ДНК було встановлено, що позитивними на Babesia spp. є 4,2 % кліщів. Що стосується Rikettsia spp. було виявлено 13 позитивних кліщів, що становило 54,2%. При дослідженні на Borrelia spp було виявлено 33,3% кліщів з ДНК збудника. При третьому способі досліджень також було виявлено 4,2% кліщів з ДНК Babesia spp.. ДНК рикетсій було виявлено у 7 кліщів D. reticulatus та 2 кліщів I. ricinus, що разом становило 37,5%. ДНК Borrelia spp. були виявлені також серед 37,5% кліщів. Таким чином, комбінований метод механічної гомогенізації кліщів в комбінації з комерційним набором для ізоляції ДНК, пропонує максимальну ефективність з точки зору швидкості, кількості та розміру зразків, що підлягають дослідженню.
Посилання
2. Briciu, V. T., Titilincu, A., Tăţulescu, D. F., Cârstina, D., Lefkaditis, M., & Mihalca, A. D. (2011). First survey on hard ticks (Ixodidae) collected from humans in Romania: possible risks for tick-borne diseases. Experimental & applied acarology, 54(2), 199–204. https://doi.org/10.1007/s10493-010-9418-0
3. Crowder, C. D., Rounds, M. A., Phillipson, C. A., Picuri, J. M., Matthews, H. E., Halverson, J., Schutzer, S. E., Ecker, D. J., & Eshoo, M. W. (2010). Extraction of total nucleic acids from ticks for the detection of bacterial and viral pathogens. Journal of medical entomology, 47(1), 89–94. https://doi.org/10.1603/033.047.0112
4. Elston D. M. (2010). Tick bites and skin rashes. Current opinion in infectious diseases, 23(2), 132–138. https://doi.org/10.1097/QCO.0b013e328335b09b
5. Földvári, G., Široký, P., Szekeres, S., Majoros, G., & Sprong, H. (2016). Dermacentor reticulatus: a vector on the rise. Parasites & vectors, 9(1), 314. https://doi.org/10.1186/s13071-016-1599-x
6. Guy, E. C., & Stanek, G. (1991). Detection of Borrelia burgdorferi in patients with Lyme disease by the polymerase chain reaction. Journal of clinical pathology, 44(7), 610–611. https://doi.org/10.1136/jcp.44.7.610
7. Halos, L., Jamal, T., Vial, L., Maillard, R., Suau, A., Le Menach, A., Boulouis, H. J., & Vayssier-Taussat, M. (2004). Determination of an efficient and reliable method for DNA extraction from ticks. Veterinary research, 35(6), 709–713. https://doi.org/10.1051/vetres:2004038
8. Hill, C. A., & Gutierrez, J. A. (2003). A method for extraction and analysis of high quality genomic DNA from ixodid ticks. Medical and veterinary entomology, 17(2), 224–227. https://doi.org/10.1046/j.1365-2915.2003.00425.x
9. Hubbard, M. J., Cann, K. J., & Wright, D. J. (1995). Validation and rapid extraction of nucleic acids from alcohol-preserved ticks. Experimental & applied acarology, 19(8), 473–478. https://doi.org/10.1007/BF00048266
10. Levytska, V.A., & Mushinsky, A.B. (2019). Monitoring of vector-borne diseases in the west part of Ukraine. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Veterinary sciences, 21(96), 14–18. doi: 10.32718/nvlvet9603 [In Ukrainian]
11. Mahittikorn, A., Wickert, H., & Sukthana, Y. (2005). Comparison of five DNA extraction methods and optimization of a b1 gene nested PCR (nPCR) for detection of Toxoplasma gondii tissue cyst in mouse brain. The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 36(6), 1377–1382.
12. Mahittikorn, A., Wickert, H., & Sukthana, Y. (2005). Comparison of five DNA extraction methods and optimization of a b1 gene nested PCR (nPCR) for detection of Toxoplasma gondii tissue cyst in mouse brain. The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 36(6), 1377–1382.
13. Marconi, R. T., & Garon, C. F. (1992). Development of polymerase chain reaction primer sets for diagnosis of Lyme disease and for species-specific identification of Lyme disease isolates by 16S rRNA signature nucleotide analysis. Journal of clinical microbiology, 30(11), 2830–2834. https://doi.org/10.1128/JCM.30.11.2830-2834.1992
14. Mierzejewska, E. J., Dwużnik, D., Koczwarska, J., Stańczak, Ł., Opalińska, P., Krokowska-Paluszak, M., Wierzbicka, A., Górecki, G., Bajer, A. (2020) The red fox (Vulpes vulpes), a possible reservoir of Babesia vulpes, B. canis and Hepatozoon canis and its association with the tick Dermacentor reticulatus occurrence,Ticks and Tick-borne Diseases, 101551,ISSN 1877-959X, https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2020.101551.
15. Mtambo, J., Van Bortel, W., Madder, M., Roelants, P., & Backeljau, T. (2006). Comparison of preservation methods of Rhipicephalus appendiculatus (Acari: Ixodidae) for reliable DNA amplification by PCR. Experimental & applied acarology, 38(2-3), 189–199. https://doi.org/10.1007/s10493-006-0004-4
16. Pangrácová, L., Derdáková, M., Pekárik, L., Hviščová, I., Víchová, B., Stanko, M., Hlavatá, H., & Peťko, B. (2013). Ixodes ricinus abundance and its infection with the tick-borne pathogens in urban and suburban areas of Eastern Slovakia. Parasites & vectors, 6(1), 238. https://doi.org/10.1186/1756-3305-6-238
17. Rauter, C., & Hartung, T. (2005). Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes ricinus ticks in Europe: a metaanalysis. Applied and environmental microbiology, 71(11), 7203–7216. https://doi.org/10.1128/AEM.71.11.7203-7216.2005
18. Rodríguez, I., Fraga, J., Noda, A. A., Mayet, M., Duarte, Y., Echevarria, E., & Fernández, C.. (2014). An Alternative and Rapid Method for the Extraction of Nucleic Acids from Ixodid Ticks by Potassium Acetate Procedure. Brazilian Archives of Biology and Technology, 57(4), 542-547. https://doi.org/10.1590/S1516-8913201402005
19. Roux, V., Rydkina, E., Eremeeva, M., & Raoult, D. (1997). Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae. International journal of systematic bacteriology, 47(2), 252–261. https://doi.org/10.1099/00207713-47-2-252
20. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., & Johne, R. (2012). PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of applied microbiology, 113(5), 1014–1026. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x
21. Sparagano, O. A., Allsopp, M. T., Mank, R. A., Rijpkema, S. G., Figueroa, J. V., & Jongejan, F. (1999). Molecular detection of pathogen DNA in ticks (Acari: Ixodidae): a review. Experimental & applied acarology, 23(12), 929–960. https://doi.org/10.1023/a:1006313803979
22. WHO, 2020. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases
Ця робота ліцензується відповідно до Creative Commons Attribution 4.0 International License.
ISSN 
ISSN 
